细胞冻存

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

基本资料

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%．15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

背景知识

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加(jiā)和(hé)体(tǐ)外(wài)环(huán)境(jìng)条(tiáo)件(jiàn)的(de)变(biàn)化(huà)而(ér)不(bù)断(duàn)有(yǒu)新(xīn)的(de)变(biàn)化(huà)。因(yīn)此(cǐ)及(jí)时(shí)进(jìn)行(xíng)细(xì)胞(bāo)冻(dòng)存(cún)十(shí)分(fēn)必(bì)要(yào)。细(xì)胞(bāo)冷(lěng)冻(dòng)储(chǔ)存(cún)在(zài)-70℃冰(bīng)箱(xiāng)中(zhōng)可(kě)以(yǐ)保(bǎo)存(cún)一(yī)年(nián)之(zhī)久(jiǔ)；细(xì)胞(bāo)储(chǔ)存(cún)在(zài)液(yè)氮(dàn)中(zhōng)，温(wēn)度(dù)达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理 ：

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透(tòu)性(xìng)，加(jiā)上(shàng)缓(huǎn)慢(màn)冷(lěng)冻(dòng)可(kě)使(shǐ)细(xì)胞(bāo)内(nèi)的(de)水(shuǐ)分(fēn)渗(shèn)出(chū)细(xì)胞(bāo)外(wài)，减(jiǎn)少(shǎo)细(xì)胞(bāo)内(nèi)冰(bīng)晶(jīng)的(de)形(xíng)成(chéng)，从(cóng)而(ér)减(jiǎn)少(shǎo)由(yóu)于(yú)冰(bīng)晶(jīng)形(xíng)成(chéng)造(zào)成(chéng)的(de)细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

操作步骤

材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱

7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头、直头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 胶塞

4. 移液管（10ml）

5. 15ml离心管

6. 冻存管（1～2ml）

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

3. 记号笔

4. 医用橡皮膏

5. 移液枪

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. 培养液

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 胰蛋白酶（0.08%）

6. 1NHCl

7. 7.4%NaHCO3

8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油

步骤

（一）细胞冻存

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去(qù)除(chú)PBS，加(jiā)入(rù)适(shì)量(liàng)胰(yí)蛋(dàn)白(bái)酶(méi)（覆(fù)盖(gài)培(péi)养(yǎng)皿(mǐn)表(biǎo)面(miàn)）把(bǎ)单(dān)层(céng)生(shēng)长(zhǎng)的(de)细(xì)胞(bāo)消(xiāo)化(huà)下(xià)来(lái)；

4. 离(lí)心(xīn)1000rpm，5min；

5. 去(qù)除(chú)胰(yí)蛋(dàn)白(bái)酶(méi)，加(jiā)入(rù)适(shì)量(liàng)配(pèi)制(zhì)好(hǎo)的(de)冻(dòng)存(cún)培(péi)养(yǎng)液(yè)，用(yòng)吸(xī)管(guǎn)轻(qīng)轻(qīng)吹(chuī)打(dǎ)使(shǐ)细(xì)胞(bāo)均(jūn)匀(yún)，计(jì)数(shù)，调(diào)节(jié)冻(dòng)存(cún)液(yè)中(zhōng)细(xì)胞(bāo)的(de)最(zuì)终(zhōng)密(mì)度(dù)为(wèi)5×106/ml～1×107/ml；

6. 将(jiāng)细(xì)胞(bāo)分(fēn)装(zhuāng)入(rù)冻(dòng)存(cún)管(guǎn)中(zhōng)，每(měi)管(guǎn)1～1.5 ml；

7. 在(zài)冻(dòng)存(cún)管(guǎn)上(shàng)标(biāo)明(míng)细(xì)胞(bāo)的(de)名称(chēng)，冻(dòng)存(cún)时(shí)间(jiān)及(jí)操(cāo)作(zuò)者(zhě)；

8. 冻(dòng)存(cún)：标(biāo)准(zhǔn)的(de)冻(dòng)存(cún)程(chéng)序(xù)为(wèi)降(jiàng)温(wēn)速(sù)率(lǜ)-1～-2℃/ min；当(dāng)温(wēn)度(dù)达(dá)-25℃以(yǐ)下(xià)时(shí)，可(kě)增(zēng)至(zhì)-5℃～-10℃/min；到(dào)-100℃时(shí)，则(zé)可(kě)迅(xùn)速(sù)浸(jìn)入(rù)液(yè)氮(dàn)中(zhōng)。也(yě)可(kě)将(jiāng)装(zhuāng)有(yǒu)细(xì)胞(bāo)的(de)冻(dòng)存(cún)管(guǎn)放(fàng)入(rù)-20℃冰(bīng)箱(xiāng)2h ，然(rán)后(hòu)放(fàng)入(rù)-70℃冰(bīng)箱(xiāng)中(zhōng)过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二） 细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融(róng)化(huà)。

2. 从(cóng)37℃水(shuǐ)浴(yù)中(zhōng)取(qǔ)出(chū)冻(dòng)存(cún)管(guǎn)，打(dǎ)开(kāi)盖(gài)子(zi)，用(yòng)吸(xī)管(guǎn)吸(xī)出(chū)细(xì)胞(bāo)悬(xuán)液(yè)，加(jiā)到(dào)离(lí)心(xīn)管(guǎn)并(bìng)滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养(yǎng)瓶(píng)，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。