流式细胞术

流式细胞术（英语：flow cytometry）是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术（Flow Cytometry，FC）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

原理

一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直线上（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所(suǒ)带(dài)有(yǒu)的(de)荧(yíng)光(guāng)化(huà)合(hé)物(wù)被(bèi)激(jī)发(fā)并(bìng)发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者膜的粗糙程度），至于荧光则用来标记和检测特定的细胞表面抗原或者DNA。

可以检测的参数有：

细胞的体积和形态复杂程度

细胞中的色素

DNA（细胞周期分析[1][2]、细胞动力学、细胞增殖等）

RNA

染色体分(fēn)析(xī)和(hé)分(fēn)选(xuǎn)（文库(kù)构(gòu)建(jiàn)、染(rǎn)色(sè)体(tǐ)涂(tu)染(rǎn)）

蛋(dàn)白(bái)质(zhì)

细(xì)胞(bāo)表(biǎo)面(miàn)抗(kàng)原(yuán)（CD标(biāo)记(jì)）

胞(bāo)内(nèi)抗(kàng)原(yuán)（各(gè)种(zhǒng)细(xì)胞(bāo)因(yīn)子(zi)(cytokine)、次(cì)级(jí)媒(méi)介(jiè)等(děng)）

核(hé)抗(kàng)原(yuán)

酶(méi)活(huó)性(xìng)

pH，胞(bāo)内(nèi)离(lí)子(zi)化(huà)的(de)钙(gài)、镁(měi)，膜(mó)电(diàn)势(shì)

膜(mó)流(liú)动(dòng)性(xìng)

细(xì)胞(bāo)凋(diāo)亡(wáng)(apoptosis)

定(dìng)量(liàng)检(jiǎn)测(cè)DNA降(jiàng)解(jiě)

粒(lì)腺(xiàn)体(tǐ)膜(mó)电(diàn)位(wèi)通(tōng)透(tòu)性(xìng)变(biàn)化(huà)

细(xì)胞(bāo)膜(mó)上(shàng)不(bù)对(duì)称(chēng)性(xìng)的(de)瓦(wǎ)解(jiě)

细(xì)胞(bāo)凋(diāo)亡(wáng)蛋(dàn)白(bái)质(zhì)活(huó)性(xìng)侦(zhēn)测(cè)（caspase activity）

细(xì)胞(bāo)存(cún)活(huó)能(néng)力(lì)

监(jiān)测(cè)细(xì)胞(bāo)电(diàn)通(tōng)透(tòu)性(xìng)

氧爆作用(oxidative burst)

研究癌细胞中的多(duō)重(zhòng)耐(nài)药(yào)性(xìng)（multi-drug resistance, MDR）

谷胱甘肽

各种组合（DNA/表面抗原等等）

这个列表非常长，而且在不断地扩展。

流式(shì)细胞仪

台式流式细胞仪的前视图 - 美国BD公司(Becton-Dickinson)荧光激活细胞分选仪（FACSCalibur）

流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光激活细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。

现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。

流式细胞仪(yí)和(hé)显(xiǎn)微(wēi)镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。

一个流式细胞仪包括五个组成部分：

细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式逐个通过(guò)光(guāng)束(shù)。

光(guāng)源(yuán)：有(yǒu)通(tōng)常(cháng)的(de)灯(dēng)（汞(gǒng)或(huò)氙(xiān)）、高(gāo)功(gōng)率(lǜ)水(shuǐ)冷(lěng)的(de)激(jī)光(guāng)源(yuán)（氩(yà)、氪(kè)、染(rǎn)料(liào)激(jī)光(guāng)）、低(dī)功(gōng)率(lǜ)气(qì)冷(lěng)激(jī)光(guāng)（氩(yà)(488nm)，红(hóng)氦(hài)氖(nǎi)(633nm)，绿(lǜ)氦(hài)氖(nǎi)，氦镉(紫外)）、激光二极管或激光二极管倍频（蓝、绿、红、紫）。

检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。

放大系统，线性或对数放大。

计(jì)算(suàn)机(jī)，用(yòng)于(yú)分(fēn)析(xī)信(xìn)号(hào)。

早(zǎo)期(qī)的(de)流(liú)式(shì)细(xì)胞(bāo)仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的(de)试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同。

通过流式细胞仪获取样本数据的过程叫做“获取过程”（acquisition）。这个过程是以连接在流式细胞仪的计算机，和处理细胞计数器的软件为媒介的。其中，软件可以调节用于检测样本的不同参数值，如电压（voltage），补偿（compensation）等，并且在获取样本数据时协助样本信息的数字显示，以确保参数正确的设置。现代的流式细胞仪很多应用在荧光标记（ fluorescently labeled ）的抗体（antibody）上。

现代流式细胞仪通常拥有多种激光和多种荧光检测。 最近数据显示商用流式细胞仪有高达10种激光， 18种荧光检测器。这个数字的增长可以使得更多的抗体被标记，并且通过表现型标记（ phenotypic markers）识别到可观的样本数量。 有些设备甚是可以获取单个细胞的数字图像，用于分析荧光在细胞中的具体位置（比如细胞内部，细胞表面等）。

数据分析

通(tōng)过(guò)流(liú)式(shì)细胞术分析海水样品中的光合浮游生物，显示三种不同的群体（原绿球藻，聚球藻，和picoeukaryote）

补(bǔ)偿(cháng)（compensation）

每(měi)种(zhǒng)荧(yíng)光(guāng)染(rǎn)料(liào)都(dōu)具(jù)有(yǒu)广(guǎng)泛(fàn)的(de)荧(yíng)光(guāng)光(guāng)谱(pǔ)。 当(dāng)使(shǐ)用(yòng)多(duō)种荧光染料时，可能会发生荧光染料之间的重叠。 这种情况被称为频谱重叠。 这种情况需要克服。 例如，FITC和PE的发射光谱是荧光素发射的光在穿过用于PE的滤光片时重叠相同的波长。 通过从PE信号中去除(chú)一(yī)部(bù)分(fēn)FITC信(xìn)号(hào)来(lái)校(xiào)正(zhèng)该(gāi)频(pín)谱(pǔ)重(zhòng)叠(dié)，反(fǎn)之(zhī)亦(yì)然(rán)。 这(zhè)个(gè)过(guò)程(chéng)被(bèi)称(chēng)为(wèi)色(sè)彩(cǎi)补(bǔ)偿(cháng)，它(tā)将(jiāng)荧(yíng)光(guāng)色(sè)素(sù)计算为百分比来衡量自身[3]。

圈选（gates）

由流式细胞仪得到的数据可以由新的软件绘制成一维的柱状图（histograms）或是二维甚至是三维的位图（dot plots），进一步由所谓的"圈选"（gates）位图的方式，可将位图的点图区域不断地作一系列的分离及再分析。而特殊的圈选流程（protocols）对于血液学方面在临床上的诊断有相当的关连(lián)性(xìng)。

这(zhè)类(lèi)位(wèi)图(tú)经(jīng)常(cháng)以(yǐ)对(duì)数(shù)（logarithmic）尺(chǐ)标(biāo)的(de)方(fāng)式来呈现。由于荧光染剂彼此会有光谱波长重叠的情形，而荧光波长呈现的讯号常会被来自荧光接受器的讯号所干扰，因此需由电子运算的方式进行荧光补偿（compenstation）。从流式细胞仪中获取到的数据可以通过以下(xià)软(ruǎn)件(jiàn)进(jìn)行(xíng)分(fēn)析(xī)：e.g., JMP_(statistical_software), WinMDI,[9] Flowing Software,[10] and web-based Cytobank[11] (all freeware), FCS Express （页面存档备份，存于互联网档案馆）, FlowJo, FACSDiva, CytoPaint (aka Paint-A-Gate),[12] VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt or Cytospec.[13] 一旦数据收集的过程已经结束，流式细胞仪就不用继续连接在计算机中。后续的数据分析可以在计算机中独立进行，这一点尤其用在一些高精度需求的仪器上。

计算分析

最近在使用计算方法进行自动化群体识别方面的进展为传统的圈选策略（gating strategies）提供了一种替代方案。 自动识别系统可能有助于发现罕见和隐藏的人群。 代表性的自动化方法包括FLOCK[4]，免疫学数据库和分析门户（ImmPort）[5]，Bioconductor中的SamSPECTRAL [6]和flowClust[7][8][9]以及GenePattern中的FLAME[10]。

应用

流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学、植物学、和海洋生物学等[11]。在分子生物学中，它(tā)主要(yào)用(yòng)于(yú)荧(yíng)光(guāng)标(biāo)记(jì)的(de)抗(kàng)体(tǐ)。特(tè)异(yì)性(xìng)的(de)抗(kàng)体(tǐ)与(yǔ)靶(bǎ)细(xì)胞(bāo)上(shàng)的(de)抗(kàng)原(yuán)结(jié)合(hé)，能(néng)够(gòu)通(tōng)过(guò)流(liú)式(shì)细(xì)胞(bāo)仪(yí)研(yán)究(jiū)这(zhè)些(xiē)细(xì)胞(bāo)的(de)特(tè)别(bié)信(xìn)息(xi)。这(zhè)在(zài)医(yī)学(xué)中(zhōng)具(jù)有(yǒu)很(hěn)广(guǎng)泛(fàn)的(de)应(yīng)用(yòng)，尤(yóu)其(qí)是(shì)在(zài)器(qì)官(guān)移(yí)植(zhí)、血(xuè)液(yè)学(xué)、肿(zhǒng)瘤(liú)免(miǎn)疫(yì)学(xué)和(hé)化(huà)疗(liáo)、遗(yí)传(chuán)学(xué)、精(jīng)子(zi)分(fēn)类(lèi)（Sperm sorting）、和(hé)性(xìng)别(bié)选(xuǎn)择(zé)。此(cǐ)外(wài)，它(tā)广(guǎng)泛(fàn)用(yòng)于(yú)检(jiǎn)测(cè)DNA损(sǔn)伤(shāng)[12][13]，半(bàn)胱(guāng)氨(ān)酸(suān)蛋(dàn)白(bái)酶(méi)切(qiè)割(gē)和(hé)细(xì)胞(bāo)凋(diāo)亡(wáng)的(de)研(yán)究(jiū)[14]。 在(zài)神(shén)经(jīng)科(kē)学(xué)中(zhōng)，细(xì)胞(bāo)表(biǎo)面(miàn)的(de)共(gòng)表(biǎo)达(dá)（co-expression）和(hé)细(xì)胞(bāo)外(wài)抗(kàng)原(yuán)（intracellular antigens）可(kě)以(yǐ)被(bèi)分(fēn)析(xī)[15]。

现(xiàn)代(dài)的(de)流(liú)式(shì)细(xì)胞(bāo)仪(yí)具(jù)有(yǒu)多(duō)个(gè)激(jī)光(guāng)和(hé)荧(yíng)光(guāng)检(jiǎn)测(cè)器(qì)（目(mù)前(qián)商(shāng)业(yè)用(yòng)仪(yí)器(qì)的(de)记(jì)录(lù)是(shì)4个(gè)激(jī)光(guāng)和(hé)14个(gè)检(jiǎn)测(cè)器(qì)），可(kě)以(yǐ)用(yòng)于(yú)多(duō)个(gè)抗(kàng)体(tǐ)标(biāo)记(jì)，以(yǐ)便(biàn)在(zài)表(biǎo)现(xiàn)型(xíng)中(zhōng)更(gèng)准(zhǔn)确(què)地(de)区(qū)别(bié)某(mǒu)个(gè)靶(bǎ)群(qún)体(tǐ)。

流(liú)式(shì)细(xì)胞(bāo)仪(yí)也(yě)是(shì)很(hěn)有(yǒu)用(yòng)的(de)分(fēn)选(xuǎn)仪(yí)器(qì)。当(dāng)细(xì)胞(bāo)/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。

海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻（Prochlorococcus）就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。